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技術(shù)文章

關(guān)于酶聯(lián)免疫檢測法,一定要注意了！

點擊次數(shù)：14773   發(fā)布時間：2020/11/3 9:28:07

目前酶聯(lián)免疫法檢測用試劑盒種類繁多，在實際檢測中發(fā)現(xiàn)，一般在試劑盒說明書中列出以下指標：檢測限；回收率；交叉反應(yīng)率；標準曲線圖譜及數(shù)據(jù)，標準曲線至少由5個濃度組成；IC50測定值及變形曲線點數(shù)目的是比較規(guī)范的試劑盒，可以選擇。

1.臨界值(cut-off)的確定
在實際使用酶聯(lián)免疫法檢測時要首先確定臨界值。通過檢測結(jié)果與臨界值的比較，可判定樣品為陰性或可疑。對于禁用藥物，檢測方法的臨界值為定量限，即現(xiàn)有的公認的儀器檢測所能達到的定量限。對于有殘留限量(MRL)的藥物，檢測方法的臨界值為20份添加MRL濃度的樣品重復(fù)3次測定的均值減去1．64倍標準差。檢測結(jié)果如小于臨界值為陰性，大于或等于臨界值或標準規(guī)定為可疑，需要用確證法確證。

2.檢測限的測定 可添加MRL和MRL上下各一個濃度。
每個試驗室在使用酶聯(lián)免疫法檢測時，應(yīng)做一下各自試驗室的檢測限。檢測限為20份空白樣品測定的均值加3倍標準差。如果經(jīng)規(guī)范操作后所得檢測限大于臨界值時，說明試劑盒背景干擾大，試劑盒靈敏度不能滿足檢測要求，應(yīng)與試劑盒廠家聯(lián)系或棄去不用選用另外的試劑盒。

3.酶聯(lián)免疫檢測方法驗證
在使用酶聯(lián)免疫法檢測樣品時，應(yīng)對方法進行驗證。主要測定以下內(nèi)容：
①標準曲線的測定，標準曲線至少由5個濃度組成，測定次數(shù)不少于5次，以確定工作濃度范圍和IC50范圍。一般臨界值為IC50附近，檢測靈敏度高。
②樣品檢測限的測定。
③樣品添加回收實驗。對禁用藥物可添加定量限和2倍定量限，對于有殘留限量(MRL)的藥物，可添加MRL和MRL上下各一個濃度。

準確度：若回收率大于40％符合相應(yīng)檢測標準的要求。精密度：批內(nèi)變異系數(shù)每批平行樣之間的變異系數(shù)小于或等于25％，對于禁用藥物小于或等于30％。批間變異系數(shù)所有樣品間變異系數(shù)小于或等于30％，對于禁用藥物小于或等于40％。滿足以上準確度和精密度要求，說明酶聯(lián)免疫方法可行，可用來檢測藥物殘留。

4.其他
①對于可用于多殘留檢測的試劑盒，以交叉反應(yīng)率低的藥物做陽性添加測定臨界值(cut-off)。
②實際檢測樣品時要包括以下實驗：至少做兩條標準曲線，兩個陰性對照品，兩個添加臨界值(cut-off)的陽性對照品，兩個平行的待檢樣品。檢測結(jié)果出來后通過標準曲線形狀(符合檢測要求為S形)，IC50與臨界值是否相近及陽性樣品回收率，樣品平行情況可確定檢測是否可信。

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