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技術(shù)文章

引物純化方式有哪些,如何選擇?

點擊次數(shù)：14614   發(fā)布時間：2020/7/15 9:20:05

1.脫鹽

寡核苷酸合成后，為了純化寡核苷酸成為天然的DNA結(jié)構(gòu)，首先必須去除保護基團。通過濃氨水處理，合成的寡核苷酸從固相載體上分離，2-氰乙氧基－－磷酸二脂鍵的保護基團，以及堿基的保護基團基（苯甲�；彤惗』┍蝗コ瑥亩纬闪颂烊坏腄NA結(jié)構(gòu)。然而，必要的去保護步驟完成后，寡核苷酸混合物還包含幾種必須被去除的小分子有機化合物。所有非必須有機化合物被移除的過程通常叫做脫鹽。脫鹽純化可以借助反向硅膠柱進行。盡管脫鹽純化可以移除所有的非必須有機雜質(zhì)，但它不能有效移除合成中產(chǎn)生微量的提前終止的寡核苷酸雜鏈。然而，脫鹽的寡核苷酸還是能夠滿足ＰＣＲ檢測等基礎(chǔ)生物研究。

2.BioRP / OPC純化

如果寡核苷酸以“三苯甲基”的形式合成，則N-甲基寡核苷酸包含5’-DMT基團，提前終止的寡核苷酸不包含該基團。因為DMT基有強的親脂的特性，有5’-DMT基團的寡核苷酸與反相樹脂有親和性，因此反相親和樹脂通常被用于寡核苷酸的純化。利用反向樹脂和5’－DMT寡核苷酸存在強親和力，但是提前終止的寡核苷酸不包含DMT基團，所以，我們能夠成功的把想要的N-甲基寡核苷酸從提前終止的寡核苷酸雜質(zhì)中分離出來。

3.HPLC

如果合成的寡核苷酸應(yīng)用于克隆，定向誘變或定量的基因探測，那么對其純度要求較高。脫鹽或OPC純化的寡核苷酸可能達不到要求，則HPLC純化被廣泛地用于這個目的。作為一種純化樹脂，陰離子交換樹脂或反向樹脂被用于寡核苷酸純化。陰離子交換樹脂的HPLC通常顯示95-98%純化效率，對于達到35-mer寡核苷酸的純化是充分的。反向樹脂化的HPLC與陰離子交換樹脂的HPLC呈現(xiàn)相似的純化效率。因為HPLC的純化效率很大程度依靠寡核苷酸的長度，用HPLC法不能有效純化長的寡核苷酸（大于35-mer)。

4.PAGE

對于長的寡核苷酸的純化（50-100mer），我們推薦PAGE純化法，它使用交連的聚丙烯酰胺凝膠(電泳)作為純化基質(zhì)。盡管PAGE顯示出高的純化效率（＞98%），但它在額外的步驟方面有一些缺陷，比如在PAGE之后需要提取和脫鹽，繼而將導(dǎo)致純化產(chǎn)率的下降。

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