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抗體效價(jià)的檢測、抗體的純化你了解多少嗎？

點(diǎn)擊次數(shù)：15029   發(fā)布時(shí)間：2019/4/26 10:49:01

抗體：機(jī)體在抗原物質(zhì)刺激下，由B細(xì)胞分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白。免疫球蛋白英文縮寫為Ig.

抗體的效價(jià)：指抗體的物理狀態(tài)及其在體內(nèi)的滯留時(shí)間，以其與抗原反應(yīng)的多少來表示其免疫效果。

抗體效價(jià)的檢測（一般用ELISA間接法進(jìn)行檢測）
1）2個(gè)參照:陰性參照為預(yù)取血血清，均以1抗起始濃度稀釋;陽性參照為以前陽性血清或者細(xì)胞上清
2）于96空板中每孔適量的抗原，邊沿孔應(yīng)盡量避免使用，會(huì)降低細(xì)光值,影響結(jié)果。于4℃過夜，緊急情況也可以37℃孵育2小時(shí)。
3）倒掉抗原，每孔加入200ul的封閉液，4℃過夜或者37℃孵育2小時(shí)。
4）倒去封閉液，在吸水紙上拍打盡量吸干殘留液體,用洗滌液洗板三次,每次盡量拍干殘留液體,若要放置一段時(shí)間,盡量風(fēng)干板子,或30℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。
5）取包好的96孔板，一孔加入陰性參照液50ul，第二孔加入陽性參照液50ul，第三孔加入稀釋的抗體（1：500=抗體：封閉稀釋液），后面的第四孔到第12孔加入50ul的封閉稀釋液，然后取50ul稀釋的抗體進(jìn)行梯度稀釋，第12孔取出50ul的液體，保證每孔液體為50ul。再于37℃孵育1 小時(shí)。
6）倒掉液體，用洗滌液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的HRP標(biāo)記的2抗（1：2000），于37℃孵育45分鐘。
7）倒掉液體，有洗滌液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的TMB底物（A+B等體積配置，現(xiàn)配現(xiàn)用）溫室孵育5—20分鐘(根據(jù)顏色的改變速度)。
8）每孔加入100ul的終止液（0.M草酸），在酶標(biāo)儀上讀取450nm的吸光度。

抗體的純化。（一般用親和純化，這種方法得到的抗體的純度高一些。）
(1) 親和柱的制備
1）稱取0.3mg溴化QING活化的瓊脂糖凝膠加入1mmol／L的鹽酸中，4`C過夜使其充分溶漲，可獲得1ml溶漲膠。
2）將凝膠轉(zhuǎn)移入純化柱中，用約30ml 1mmol／L的鹽酸洗介質(zhì)3次。
3）用偶聯(lián)緩沖液洗介質(zhì)一次，因?yàn)榛罨鶊F(tuán)在偶聯(lián)緩沖液PH值下易水解，所以此步驟zui hao在幾分鐘內(nèi)完成。
4）將溶解在5ml偶聯(lián)緩沖液中的10-60nmol的配體加入凝膠中，如需測定結(jié)合效率一定要取少量陪體溶液待測。
5）溫室下輕輕混合搖動(dòng)2小時(shí)，或4`C過夜，如需測定結(jié)合效率此步驟結(jié)束后取少量溶液待測。
6）用30ml的偶聯(lián)緩沖液洗介質(zhì)一次。
7）加入15ml阻斷緩沖液溫室孵育2小時(shí)或4`C過夜。
8）依次用20ml的偶聯(lián)緩沖液和20ml的乙酸鹽緩沖液洗介質(zhì)一次。重復(fù)4次步驟8。
9）重復(fù)4次步驟8。
10）配體固相化完成，可用于純化。
11）若不立即使用，用20%的乙醇封存。
（2）抗體的純化
1）原血清用PBS等體積稀釋，混勻1min，5000-10000r／min，4-20離心15分鐘，取上清，并留樣送檢。
2）用層析儀或手工，10倍體積的PBS 2-4ml／min流速清洗平衡柱子。
3）稀釋離心完的上清樣品，0.5-1ml／min流速上樣。
4）上樣完后，用15倍體積的PBS2-4ml／min流速清洗平衡柱子，洗去柱子上殘留的雜蛋白。
5）用5-10倍體積的Anitibody Elute Buffer C 洗脫結(jié)合在親和柱子上的抗體，分管收集，沒管收集1ml并預(yù)先滴加100ul Anitibody Elurte Buffer D調(diào)PH至中性（PH7-7.5），如果有層析儀也可以根據(jù)層析儀紫外吸收峰檢測收集。
6）洗脫完畢后，柱子用5倍體積的PBS 2-4mi／min流速清洗平衡。
7）用20%的酒精封存柱子，4`C保存。
（3）抗體的濃縮
1）一般收集濃度較高的幾管洗脫液，無須濃縮，若弄多實(shí)在太低（小于0.5mg／ml），則將收集的餾分加和起來。
2）轉(zhuǎn)移入15ml 的超濾管，3500r／min離心20分鐘左右（根據(jù)要濃縮的體積摸索離心時(shí)間），將濃縮好的抗體小心的用移液器取出來。
3）取700ul 濃縮的抗體檢測280nm的吸光度，讀數(shù)不要超過2，用吸光度讀數(shù)除以1.35，即為抗體的大致濃度�？贵w的濃度也可以用（OD280nm-0.35xOD495nm）1.4這個(gè)公式計(jì)算。濃縮的程度：使抗體的濃度在0.5-1mg／ml之間zuihao。zuihou通過濃度x體積計(jì)算抗體的總量。
（4）抗體的保存
抗體中添加40-50%甘油，可以短時(shí)間存放于4℃，如需以后使用，一般500ul／管凍存于-20℃或者更低溫度的冰箱中。
（5)抗體純度的鑒定
 一般而言，我們?cè)趯⒖贵w純化以后，如果想知道抗體的純度和濃度究竟怎么樣，就需要走個(gè)SDS-PAGE電泳。電泳的方法在網(wǎng)上到處都是，在此就不多說了。

原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司

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