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技術文章

實驗中抗體的選擇方法

點擊次數：14904   發(fā)布時間：2015/8/13 9:14:32

抗體是一種由漿細胞（效應B細胞）分泌，被免疫系統(tǒng)用來鑒別與中和外來物質如細菌、病毒等的大型Y形蛋白質。不同的實驗使用的抗體也大為不同，我們根據試驗應用的類型、樣本的種屬、樣本蛋白的結構性質、抗體宿主的種類以及抗體的標記和檢測具體情況選擇*符合實驗實際操作情況的單抗和二抗。
1.分析實驗應用的類型
一般抗體說明書都列出該抗體經試驗驗證過適用于何種分析類型，如：可以應用于WB IHC ICC ELASA分析等，如果抗體說明書沒有提及的應用類型，并不意味著該抗體不適用于此種分析應用類型，而僅是說明尚未經過此種分析試驗驗證，如果抗體不適用某些分析試驗，則會在抗體說明書上標注出來不適于某分析試驗。
2.樣本的物種
應選擇物種相同或有交叉反應的抗體，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反應，因其氨基酸序列同源性較高，如果樣本的種類未列入抗體說明書上的交叉反應種屬表中，并不意味著該抗體不適用于檢測該物種的蛋白，而只是表示該物種尚未用此抗體檢測驗證過，應通過序列比對的方法來預測交叉反應，可應用Expasy 和 NCBI BLAST來進行不同物種蛋白同源性比對。
3.樣本蛋白的結構性質
了解樣本蛋白的結構性質有助于選擇*合適的抗體，至少兩方面因素需要考慮
1）.待測樣本蛋白的結構域：抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來，其中的免疫原包括：全長蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機體（如：細菌）或細胞，抗體說明書一般都有免疫原的描述，如果打算檢測的是蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長的某一區(qū)域，則必須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。如果打算用FACS流式檢測活細胞的表面蛋白，則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來免疫制備的抗體。
2）.樣本的提取或處理過程：某些抗體要求樣本經過某些特殊處理，例如：許多抗體只識別還原和變性的、表位已暴露不受二級四級結構阻礙的蛋白樣本，另一方面，某些抗體僅識別天然折疊狀態(tài)的蛋白。當選擇免疫組化的抗體時，應注意某些抗體只識別未固定的冷凍的組織，而另一些抗體則適用于無需抗原修復解交聯(lián)步聚的甲醛固定石蠟包埋的組織，這些都會在抗體說明書上應用部分標示出來
4.一抗宿主物種的選擇
一般說來，在使用偶聯(lián)二抗結合無偶聯(lián)物的一抗時，一抗宿主動物的物種選擇較為重要，對于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內源性免疫球蛋白產生交叉反應，例如：檢測小鼠樣本蛋白，則不應選擇小鼠或大鼠源的一抗，選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。如果選擇有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的其它對不含內源性免疫球蛋白樣本的檢測方法，則抗體宿主物種的影響不大，如對不含IgG的細胞裂解物樣本的western blotting檢測，盡管如此，含有血清的組織裂解物和組織培養(yǎng)上清中含有免疫球蛋白，還原變性樣本中含IgG，在western blot檢測中則結合出現(xiàn)IgG分子50 ａnd 25 kDa的重鏈和輕鏈條帶。
5.二抗的選擇
二抗應選用與使用的一抗相同的物種來源，例如：如果你的一抗是小鼠的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗anti-mouse secondary。建議檢查二抗說明書確保該抗體適用于你的檢測應用， 二抗一般連接熒光素FITC或發(fā)光團。
6.雙重染色抗體的選擇
用未偶聯(lián)一抗進行細胞培養(yǎng)物或組織切片的雙重免疫染色要求一抗來源于不同物種并且二抗分別識別其中，二抗說明書應描述其與其它物種來源的免疫球蛋有否有交叉吸附。
7.熒光和化學發(fā)光標記
連接于二抗的標記物是為了檢測抗體的結合，選擇標記物依賴于幾個參數：
檢測方法：
熒光或著色沉淀，熒光標記物用特殊波長的光激發(fā)時發(fā)射出可見光。

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原創(chuàng)作者：上海恒遠生物技術發(fā)展有限公司

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